Das Spiel beginnt damit, dass Chell in einem kleinen Glasraum aufwacht, der nur ein Bett, eine Toilette und ein Radio enthält. Ihr wird von GLaDOS mitgeteilt, dass die Tests bald beginnen werden, und ein orangefarbenes Portal öffnet sich an einer der Wände. Sobald die Spielerin hindurchgeht, betritt sie die Testräume und beginnt mit den Tests. Es gibt insgesamt 20 Testräume, die als Testkammern bezeichnet werden.
Die Tests beginnen einfach. Chell muss Schachteln, so genannte "Weighted Storage Cubes" (kurz "Würfel"), aufnehmen und sie auf Knöpfe stellen, die die Tür zum Ausgang der Kammer öffnen. An diesem Punkt spricht GLaDOS mit Chell als Leitfaden, lobt sie und verspricht ihr Kuchen, wenn die Tests beendet sind. Zu Beginn des Spiels erhält Chell das Aperture Science Handheld-Portalgerät, auch bekannt als die Portal Gun. Zunächst stellt ihre Portal Gun nur blaue Portale her, und die orangefarbenen Portale werden von GLaDOS hergestellt. Später erhält Chell die vollständige Portalwaffe und kann sowohl blaue als auch orangefarbene Portale herstellen.
Die Tests werden mit zunehmendem Alter immer gefährlicher. In einigen Räumen befindet sich Gift auf dem Boden. In anderen befinden sich Kugeln aus Elektrizität, so genannte High Energy Pellets, die Chell töten, wenn sie sie berührt. Während dieser Tests wird GLaDOS immer sarkastischer und gibt Chell nutzlose Ratschläge, wie zum Beispiel: "Der Boden hier wird Sie töten. Versuchen Sie, ihn zu vermeiden." Irgendwann teilt GLaDOS Chell mit, dass eine Kammer zerbrochen ist und sie stattdessen durch eine Kammer voller Wachgeschütze, genannt Türme, gehen muss. Wenn ein Geschützturm Chell sieht, wird er auf sie schießen, bis sie stirbt. In dieser Kammer befindet sich ein verborgener Raum. In diesem verborgenen Raum befinden sich Zeichnungen und Schriftzüge an den Wänden, die von einer unbekannten Person hinterlassen wurden. Die Schrift sagt Dinge wie "der Kuchen ist eine Lüge" und "sie schaut immer zu" mit dem Bild einer Kamera. Es gibt noch weitere solcher Räume in späteren Kammern.
In einer anderen Kammer muss Chell den gewichteten Begleitwürfel verwenden, der wie ein gewichteter Speicherwürfel mit Herzen aussieht, um den Test zu lösen. Während des Tests teilt GLaDOS Chell mehrmals mit, dass der Companion Cube nicht lebendig ist, aber am Ende des Tests sagt sie Chell, dass sie den Companion Cube "töten" muss, um zum nächsten Test zu gelangen.
Während des letzten Tests muss Chell auf einer beweglichen Plattform stehen. Am Ende der Gleise des Bahnsteigs wird er sie in eine Feuergrube tragen. GLaDOS dankt Chell für die Durchführung der Tests. In letzter Minute benutzt Chell ihre Portalkanone, um der Falle zu entkommen. Während sie versucht, aus dem Gebäude zu entkommen, wird Chell in einen Raum geführt, wo sie GLaDOS findet. Chell zerbricht eine weiße Kugel, die aus GLaDOS herausgefallen ist. GLaDOS sagt ihr, dass sie dumm war, sie zu zerbrechen, weil sie nicht wussten, was es war, aber GLaDOS findet schnell heraus, dass es ihr moralischer Kern war. Sie erzählt Chell, dass die Leute, die für Aperture Science arbeiteten, sie installiert haben, damit sie sie nicht mehr mit dem "Tödlichen Neurotoxin" tötet. Weil Chell es kaputt gemacht hat, kann GLaDOS das Neurotoxin wieder verwenden. Chell hat ein Zeitlimit von 6 Minuten, um GLaDOS zu töten, bevor das Neurotoxin Chell tötet. Nachdem er Teile von ihr abgebrochen und verbrannt hat, wird GLaDOS zerstört und Chell entkommt aus dem Gebäude.
Nachdem Chell entkommen ist, wird sie ohnmächtig, und ein Roboter schleppt sie zurück in das Gebäude. Während des Abspanns singt GLaDOS ein Lied namens "Still Alive" von Jonathan Coulton, das besagt, dass sie noch lebt, obwohl Chell sie getötet hat.
