Die Galerie beherbergt Porträts historisch wichtiger und berühmter britischer Persönlichkeiten, die auf der Grundlage der Bedeutung des Dargestellten, nicht des Künstlers, ausgewählt wurden. Die Sammlung umfasst sowohl Fotografien und Karikaturen als auch Gemälde, Zeichnungen und Skulpturen.
Eines seiner bekanntesten Bilder ist das "Chandos-Porträt", das berühmteste Porträt von William Shakespeare, obwohl es eine gewisse Unsicherheit darüber gibt, ob das Gemälde tatsächlich von dem Dramatiker stammt.
Nicht alle Porträts sind künstlerisch außergewöhnlich, obwohl es Selbstporträts von William Hogarth, Sir Joshua Reynolds und anderen namhaften britischen Künstlern gibt. Einige, wie z.B. das Gruppenporträt der Teilnehmer der Somerset House Conference von 1604, sind für sich genommen wichtige historische Dokumente. Oft ist der Wert der Neugierde größer als der künstlerische Wert eines Werkes, wie im Fall des Porträts Edward VI. von William Scrots, des Gemäldes von Patrick Brontë mit seinen Schwestern Charlotte, Emily und Anne oder einer Skulptur von Königin Victoria und Prinz Albert in mittelalterlicher Tracht. Porträts von lebenden Figuren waren ab 1969 erlaubt.
Zusätzlich zu ihren ständigen Galerien historischer Porträts zeigt die National Portrait Gallery eine rasch wechselnde Sammlung zeitgenössischer Werke, veranstaltet Ausstellungen von Porträtkunst einzelner Künstler und veranstaltet den jährlichen BP-Porträtpreis-Wettbewerb.
Die Galerie besitzt viele Porträtbüsten von Bildhauern. Die Bildhauer sind meist Briten oder in Großbritannien wohnhaft, und die Sujets sind britisch. Zu den Bildhauern gehören Poineers der modernen Bildhauerei wie Sir Jacob Epstein (14 Beispiele), Dame Elizabeth Frink (5 Beispiele), Sir Eduardo Paolozzi (vier Selbstbildnisbüsten).
