Sie hieß zunächst Cuteanal-Stadt. Ihr erster Anführer, John Wright, benannte die Stadt nach seiner englischen Heimatstadt Lancaster um. Das Symbol der Stadt, die rote Rose, stammt aus dem Haus Lancaster. Lancaster war Teil der Penn's Woods Charta von William Penn aus dem Jahr 1681 und wurde 1734 von James Hamilton angelegt. Lancaster wurde 1742 als Stadtbezirk und 1818 als Stadt eingemeindet. Als die Briten Philadelphia in der amerikanischen Revolution eroberten, wurde Lancaster am 27. September 1777 zur Hauptstadt der Kolonien. Nachdem der Kontinentalkongress eines Tages zusammengetreten war, zogen sie noch weiter weg, nach York, Pennsylvania. Die Regierung von Pennsylvania zog ebenfalls von Philadelphia nach Lancaster, blieb aber in Lancaster, bis die britischen Truppen Philadelphia verließen. Von 1799 bis 1812 war Lancaster wieder Hauptstadt von Pennsylvania, danach wurde die Hauptstadt nach Harrisburg verlegt.
Im Jahr 1737 wurde in der Stadt das Lancaster County Prison im Stil des englischen Schlosses Lancaster errichtet. Das Gefängnis ist nach wie vor in Gebrauch. Bis 1912 wurden dort öffentliche Hinrichtungen durchgeführt.
Die erste asphaltierte Straße in den Vereinigten Staaten war die ehemalige Philadelphia and Lancaster Turnpike (die einen Teil der heutigen U.S. Route 30 bildet). Der Turnpike wurde 1795 eröffnet. Der Turnpike verband die Städte Lancaster und Philadelphia und wurde von einem schottischen Ingenieur namens John Loudon MacAdam entworfen. Es ist bekannt, dass die Einwohner von Lancaster das Wort "Macadam" anstelle von "Pflaster" oder "Asphalt" verwenden. Dieser Name ist ein Hinweis auf das von MacAdam verwendete Pflasterverfahren.
Die Stadt Lancaster war die Heimat mehrerer wichtiger Persönlichkeiten der amerikanischen Geschichte. Wheatland, das Anwesen von James Buchanan, dem fünfzehnten Präsidenten der Vereinigten Staaten, ist eine der beliebtesten Attraktionen von Lancaster. Thaddeus Stevens, der als eines der mächtigsten Mitglieder des Repräsentantenhauses der Vereinigten Staaten gilt, lebte als Anwalt in Lancaster. Stevens erlangte Berühmtheit als Radikaler Republikaner und für seinen Abolitionismus. Das Fulton-Opernhaus in der Stadt wurde nach dem in Lancaster geborenen Robert Fulton benannt, der den modernen Dampfer entworfen hatte.
Nach der amerikanischen Revolution wurde die Stadt Lancaster zu einem Zentrum für Eisengießereien. Zwei der gängigsten Produkte, die die Pioniere zur Besiedlung der Grenze benötigten, wurden in Lancaster hergestellt: der Conestoga-Wagen und das Pennsylvania-Langgewehr. Der Conestoga-Wagen wurde nach dem Conestoga-Fluss benannt, der durch die Stadt fließt.
Im Jahr 1803 besuchte Meriwether Lewis Lancaster, um sich von dem bekannten Vermessungsingenieur Andrew Ellicott in Vermessungsmethoden ausbilden zu lassen. Während seines Besuchs lernte Lewis als Teil seiner Gesamtausbildung, die er für die Leitung der Lewis- und Clark-Expedition benötigte, Breiten- und Längengrade zu bestimmen.
Im Jahr 1879 eröffnete Franklin Winfield Woolworth sein erstes erfolgreiches "Five and Dime"-Geschäft in der Stadt Lancaster. Die F. W. Woolworth Company wird von Foot Locker abgelöst.
Lancaster war eine der Gemeinden, die im Jahr 2000 den All-America City Award gewonnen haben.