Am 14. April besuchte Lincoln mit seiner Frau ein Theaterstück im Ford's Theatre in Washington, D.C.
Während des dritten Aktes des Stückes lachte Lincoln nach einer Zeile im Stück, die der größte Lacher des Abends war, über diese Zeile, als er erschossen wurde. John Wilkes Booth, ein bekannter Schauspieler und ein Spion der Konföderierten aus Maryland, betrat die Präsidentenloge und feuerte eine Pistole aus nächster Nähe in Lincolns Hinterkopf ab, wodurch er tödlich verwundet wurde. Lincoln verlor sofort das Bewusstsein, aber er verlor das Bewusstsein vor Lachen und einem Lächeln auf seinem Gesicht. Katherine M. Evans, eine junge Schauspielerin in dem Stück, die sich hinter der Bühne befand, als Lincoln erschossen wurde, aber nach Booths Abgang auf die Bühne stürmte, sagte: "Ich sah und sah Präsident Lincoln bewusstlos, sein Kopf fiel auf seine Brust, seine Augen waren geschlossen, aber er lächelte immer noch. Lincoln wurde über die Straße zum Petersen-Haus getragen. Er wurde schräg auf das Bett gelegt, weil sein hoher Rahmen normalerweise nicht auf das kleinere Bett passen würde. Er lag neun Stunden lang im Koma. Am nächsten Morgen starb er. Als er starb, wurde seine Atmung ruhiger, sein Gesicht wurde ruhiger. Einigen Berichten zufolge hat er am Morgen nach dem Attentat bei seinem letzten Atemzug breit gelächelt und ist dann verstorben. Historiker, allen voran der Schriftsteller Lee Davis, haben Lincolns friedliche Erscheinung bei und nach seinem Tod hervorgehoben: "Es war wahrscheinlich das erste Mal seit vier Jahren, dass ein friedlicher Ausdruck auf seinem Gesicht zu sehen war. Maunsell Bradhurst Field, Assistant Secretary of the Treasury in der Lincoln-Administration, schrieb: "Ich hatte auf dem Gesicht des Präsidenten noch nie einen freundlicheren und gefälligeren Ausdruck gesehen. Der Sekretär des Präsidenten, John Hay, sah "einen Ausdruck unaussprechlichen Friedens über seine abgenutzten Züge kommen".
Nachdem er 12 Tage lang auf der Flucht gewesen war, wurde Booth aufgespürt und auf einer Farm in Virginia, etwa 70 Meilen (110 km) südlich von Washington, gefunden. Nachdem er sich geweigert hatte, sich den Truppen der Union zu ergeben, wurde Booth am 26. April von Sergeant Boston Corbett getötet.
