Gerichtete Evolution
Die gerichtete Evolution (DE) ist eine Methode zur Herstellung von Enzymen für industrielle oder medizinische Zwecke.
Die Methode ist das Protein-Engineering, das die natürliche Selektion nachahmt.
Die Grundidee besteht darin, ein Gen wiederholten Mutationsrunden zu unterziehen, um eine Bibliothek von Varianten zu erstellen. Durch Selektion werden Gene mit der gewünschten Funktion isoliert. Sie sind eine Vorlage für die nächste Runde.
Dies kann in vivo (in lebenden Zellen von Bakterien oder Hefe) oder in vitro (frei in Lösung oder Mikrotröpfchen) erfolgen.
Die Prüfung von mehr Mutanten erhöht die Chancen, eine mit den gewünschten Eigenschaften zu finden.
Während der In-vivo-Evolution wird jede Zelle (normalerweise Bakterien oder Hefe) mit einem Plasmid transformiert, das ein anderes Mitglied der Variantenbibliothek enthält. Nur das interessierende Gen unterscheidet sich zwischen den Zellen, während alle anderen Gene gleich bleiben.
Die Zellen exprimieren das Protein entweder in ihrem Zytoplasma oder an der Oberfläche, wo seine Funktion getestet werden kann. Dieses Format hat den Vorteil, nach Eigenschaften in einer zellulären Umgebung zu selektieren, was nützlich ist, wenn das entwickelte Protein oder die RNA in lebenden Organismen verwendet werden soll.
Wenn DE ohne Zellen durchgeführt wird, verwendet es die In-vitro-Transkriptionsübersetzung, um Proteine oder RNA frei in Lösung oder in künstlichen Mikrotröpfchen herzustellen. Dies hat den Vorteil, dass mehr Bedingungen (z.B. Temperatur, Lösungsmittel) möglich sind. Es kann Proteine exprimieren, die für Zellen toxisch wären. Darüber hinaus können in vitro-Evolutionsexperimente weitaus größere Bibliotheken (bis zu 1015) erzeugen, da die Bibliotheks-DNA nicht in Zellen eingefügt werden muss. Das schränkt oft ein, was getan werden kann.
Ein Beispiel für gerichtete Evolution mit Vergleich zur natürlichen Evolution. Der innere Zyklus zeigt die drei Stufen des gerichteten Evolutionszyklus mit dem nachgeahmten natürlichen Prozess in Klammern. Der äußere Kreis zeigt die Schritte in einem typischen Experiment. Die roten Symbole kennzeichnen funktionelle Varianten, die hellen Symbole Varianten mit reduzierter Funktion
Sicherung der Vererbung
Wenn funktionelle Proteine isoliert worden sind, ist es notwendig, dass ihre Gene es auch sind, daher ist eine Genotyp-Phänotyp-Verbindung erforderlich.
Diese kann kovalent sein, wobei das mRNA-Gen am Ende der Translation durch Puromycin an das Protein gebunden ist.
Alternativ können das Protein und sein Gen zusammen oder in Emulsionströpfchen gehalten werden. Die isolierten Gensequenzen werden dann mittels PCR oder durch transformierte Wirtsbakterien vermehrt. Als Vorlage für die nächste Mutagenese-Runde kann entweder die beste Einzelsequenz oder ein Pool von Sequenzen verwendet werden. Die wiederholten Zyklen Diversifizierung-Selektion-Amplifikation führen zu Enzymvariationen, die an den Selektionsprozess angepasst sind.
Ein exprimiertes Protein kann kovalent an sein Gen gebunden sein (wie in der mRNA), links, oder in das gleiche Kompartiment mit ihm gelegt werden, rechts. So oder so wird das Gen, das für das Protein kodiert, isoliert
Preis verliehen
Der US-Ingenieur FrancesArnold hat den Millennium Technology Prize für bahnbrechende gerichtete Evolution gewonnen.
Fragen und Antworten
F: Was ist gerichtete Evolution?
A: Gezielte Evolution (DE) ist eine Methode zur Herstellung von Enzymen für industrielle oder medizinische Zwecke. Es handelt sich um eine Form des Protein-Engineering, die die natürliche Selektion nachahmt.
F: Wie funktioniert die gerichtete Evolution?
A: Bei der gezielten Evolution wird ein Gen wiederholt mutiert, wodurch eine Bibliothek von Varianten entsteht. Durch Selektion werden dann Gene mit der gewünschten Funktion isoliert, die dann als Vorlage für die nächste Runde verwendet werden.
F: Wo kann die gezielte Evolution durchgeführt werden?
A: Gezielte Evolution kann in vivo (in lebenden Bakterien- oder Hefezellen) oder in vitro (frei in Lösung oder Mikrotröpfchen) durchgeführt werden.
F: Was sind die Vorteile der gerichteten Evolution in vivo?
A: Die gerichtete Evolution in vivo hat den Vorteil, dass man auf Eigenschaften in einer zellulären Umgebung selektieren kann, was nützlich ist, wenn das entwickelte Protein oder die RNA in lebenden Organismen verwendet werden soll.
F: Was sind die Vorteile einer gerichteten Evolution in vitro?
A: Die gerichtete Evolution in vitro hat den Vorteil, dass mehr Bedingungen (z.B. Temperatur, Lösungsmittel) möglich sind und Proteine exprimiert werden können, die für Zellen toxisch wären. Außerdem können weitaus größere Bibliotheken erzeugt werden, da die DNA nicht in die Zellen eingebracht werden muss.
F: Was schränkt die Möglichkeiten bei einem In-vitro-Experiment ein?
A: Die Größenbeschränkung für ein In-vitro-Experiment wird oft dadurch bestimmt, wie viel DNA in die Zellen eingebracht werden muss.
