1606 wurde der Smith von der Virginia Company angeheuert, um sich in der Kolonie Virginia mit Gewinn niederzulassen. Im Dezember 1606 stachen sie mit drei Schiffen in See. Die Smith hatte einen Diener namens Samuel Collier. Samuel Collier würde die meiste Zeit bei ihm bleiben.
Es gab Probleme auf der Reise, und Smith wurde wegen Meuterei angeklagt. Captain Newport plante, ihn hinzurichten. Der Kapitän eröffnete einen Befehlsbrief der Kompanie Virginia, in dem es hieß, dass Smith einer der Anführer der neuen Kolonie sein sollte, so dass Smith nicht getötet wurde.
Die Engländer kamen im April 1607 an, und Kapitän Wingfield wählte Jamestown als Standort für die Kolonie. Im Sommer lebten die Siedler noch in provisorischen Unterkünften. Nach der viermonatigen Seereise reichten die Lebensmittelvorräte nur noch für ein bis zwei Tassen Getreidemehl pro Tag pro Person. Aufgrund des Wetters und des Mangels an Nahrungsmitteln verbreiteten sich Krankheiten unter den Menschen, und bis September starb mehr als die Hälfte.
Im Dezember 1607 war Smith auf der Suche nach Nahrung und wurde von den amerikanischen Ureinwohnern gefangen genommen. Er wurde zum Treffen mit dem Häuptling des Powhatan-Stammes gebracht. Das Dorf lag etwa 15 Meilen von Jamestown entfernt. Smith wurde unverletzt freigelassen und zollte zum Teil der Tochter des Häuptlings, Pocahontas, Anerkennung, die sich auf seinen Körper stürzte. Als ihr Vater dies sah, erbarmte er sich Smith, und er wurde sicher nach Jamestown zurückgebracht. Mit dieser Begegnung begann eine freundschaftliche Beziehung zwischen den Einheimischen, Smith und den Kolonisten in Jamestown. Anfang Januar 1608 trafen fast 100 neue Siedler mit Captain Newport ein, und durch Unachtsamkeit wurde das Dorf in Brand gesteckt. In jenem Winter fror der James River zu, und die Siedler waren gezwungen, in den Ruinen zu leben. Während dieser Zeit verschwendeten Newport und seine Mannschaft viel Zeit damit, ihre Schiffe mit Eisenpyrit (Narrengold) zu beladen. Die Lebensmittelvorräte gingen zur Neige, und obwohl die Ureinwohner Amerikas etwas Nahrung mitbrachten, schrieb Smith, dass "mehr als die Hälfte von uns starb".
Im April 1608 brachte ein Schiff Vorräte und 50 neue Siedler, die Smith mit dem Bau von Wohnungen und dem Anbau von Feldfrüchten beauftragte.
Im Sommer 1608 verließ Smith Jamestown, um die Region der Chesapeake Bay zu erkunden und nach dringend benötigten Nahrungsmitteln zu suchen. Er fertigte eine Karte an, die für die Entdecker Virginias über ein Jahrhundert lang von großem Wert sein sollte. In seiner Abwesenheit ließ Smith seinen Freund Matthew Scrivener als Gouverneur an seiner Stelle zurück. Scrivener sollte später auf einer unglückseligen Reise nach Hog Island in einem Sturm ertrinken. Smith wurde im September 1608 zum Präsidenten des Gemeinderats gewählt und führte strenge Regeln ein.
Im Oktober 1608 traf ein Schiff mit 70 neuen Siedlern ein, darunter die ersten Frauen. Auch einige deutsche und polnische Handwerker kamen an, brachten aber keine Lebensmittelvorräte mit. Danach versuchte Smith, von den Ureinwohnern Amerikas Lebensmittel zu bekommen, und es bedurfte der Androhung militärischer Gewalt, damit sie gehorchten. Powhatan war erschrocken über die große Zahl weißer Männer, die in das Gebiet kamen, und versuchte, sie auszuhungern.
Smith fand heraus, dass es sowohl unter den Siedlern als auch unter den Indianern einige gab, denen seine Regeln nicht gefielen und die planten, ihn zu töten. Smith schrieb, dass er von Pocahontas gewarnt wurde. Er berief eine Versammlung ein und sagte den Männern, die nicht arbeiteten, dass "wer nicht arbeiten will, soll nicht essen...". Danach verbesserte sich die Situation.
Drei Monate lang, Anfang 1609, im Februar, März und April, war in Jamestown alles in Ordnung, es wurden viele Wohnungen gebaut, ein Hektar Land gerodet und viele andere Arbeiten erledigt. Dann, im April, zerstörten Ratten und Feuchtigkeit ihren gesamten gelagerten Mais. Sie brauchten dringend Nahrung, und Smith schickte eine große Gruppe von Siedlern zum Fischen und andere, um Schalentiere flussabwärts zu sammeln. Sie kamen ohne Nahrung zurück und waren bereit, die spärlichen Rationen zu nehmen, die ihnen angeboten wurden. Das ärgerte Smith, und er befahl ihnen, ihre Gewehre und Werkzeuge gegen Früchte der Indianer einzutauschen, und befahl allen, zu arbeiten, sonst müssten sie die Sicherheit des Forts verlassen. Einige verließen das Fort und begaben sich in die Dörfer der Indianer, aber die Menschen in Powhatan hielten sich auch an das Gesetz von Smith, das besagt: Wer nicht arbeitet, isst nicht. Dies galt so lange, bis sie fast verhungert waren und nach Hause zurückkehrten.
Irgendwann traf ein unerwartetes Schiff ein, dessen Kapitän Samuel Argall war. Er hatte Essen und Wein, die Smith mit dem Versprechen kaufte, sie zurückzuzahlen. Argall brachte auch die Nachricht, dass die Virginia Company zusammen mit einem neuen Gouverneur, Lord De la Warr, mehr Vorräte und Siedler nach Jamestown schicken würde.
Auf einer Reise nach Virginia im Mai 1609 arrangierte Sir Thomas Smith, Schatzmeister der Virginia Company, die Mitnahme von etwa 500 Kolonisten, darunter Frauen und Kinder. Eine Flotte von neun Schiffen setzte die Segel. Eines sank in einem Sturm, kurz nachdem es den Hafen verlassen hatte. Die Sea Venture erlitt auf den Bermuda-Inseln mit dem Admiral und Stephen Hopkins an Bord Schiffbruch. Ein Jahr später, im Mai 1610, waren sie in kleinen Booten, die sie gebaut hatten, in Jamestown angekommen. Gates stellte bald fest, dass es nicht genug Lebensmittel für alle in der Kolonie gab, und beschloss, Jamestown aufzugeben. Als ihre Boote das Gebiet um Jamestown verließen, trafen sie auf ein Schiff mit dem neuen Gouverneur, Lord De la Warr, der sie zurück nach Jamestown beorderte.
Im August 1609 war John Smith ziemlich überrascht über die Ankunft von mehr als 300 neuen Siedlern. London schickte neue Siedler, ohne zu planen, wie und wo sie leben sollten.
Capt. John Smith wurde durch eine versehentliche Schießpulverexplosion in seinem Kanu schwer verletzt. Smith segelte im Oktober 1609 zur Behandlung nach England. Er hatte zweieinhalb Jahre lang versucht, sein Bestes für Jamestown zu tun. Er kehrte nie nach Virginia zurück. Die Geschichte hat seinen großen Beitrag in Jamestown in seinen frühesten Jahren bestätigt.
Die Kolonisten würden weiterhin an verschiedenen Krankheiten und Leiden sterben, wobei schätzungsweise 150 der 500 Kolonisten diesen Winter überleben würden. Trotzdem finanzierte und transportierte die Virginia Company weiterhin Siedler, um Jamestown zu erhalten. In den nächsten fünf Jahren hielten die Gouverneure Gates und Sir Thomas Dale weiterhin strenge Disziplin ein, wobei Sir Thomas Smith in London versuchte, qualifizierte Handwerker und andere Siedler zu finden, die er nach Jamestown schicken konnte.
