Konstantin hatte alle 1800 Bischöfe der christlichen Kirche eingeladen (etwa 1000 im Osten und 800 im Westen), aber nur 250 bis 320 Bischöfe nahmen tatsächlich teil. Eusebius von Cäsarea zählte 250, Athanasius von Alexandria zählte 318 und Eustathius von Antiochien zählte 270 (alle drei waren beim Konzil anwesend). Später zählte Sokrates Scholasticus mehr als 300, und Evagrius, Hilarius, Hieronymus und Rufinus zählten 318.
Die Bischöfe erhielten freie Fahrt zum Konzil sowie Unterkunft und Verpflegung. Diese Bischöfe reisten nicht allein; jeder von ihnen hatte die Erlaubnis, zwei Priester und drei Diakone mitzubringen, so dass die Gesamtzahl der Anwesenden über 1500 gelegen hätte. Eusebius spricht von einer fast unzähligen Schar von begleitenden Priestern, Diakonen und Akolythen.
Diesem Rat kam auch deshalb eine besondere Bedeutung zu, weil die Christenverfolgung gerade mit dem Edikt der Kaiser Konstantin und Licinius vom Februar 313 in Mailand beendet worden war.
Die Ostbischöfe bildeten die große Mehrheit. Von diesen hatten die drei Patriarchen den ersten Rang inne: Alexander von Alexandria, Eustathius von Antiochien und Makarius von Jerusalem. Die lateinischsprachigen Provinzen entsandten mindestens fünf Vertreter: Marcus von Kalabrien aus Italien, Cäcilien von Karthago aus Afrika, Hosius von Córdoba aus Hispanien, Nicasius von Dijon aus Gallien und Domnus von Stridon aus der Donauprovinz. Papst Silvester I. war nicht anwesend und sagte, er sei krank, aber er wurde von zwei Priestern vertreten.
Athanasius von Alexandria, ein junger Diakon und Gefährte von Bischof Alexander von Alexandria, gehörte zu den Assistenten. Athanasius verbrachte schließlich den größten Teil seines Lebens damit, gegen den Arianismus zu kämpfen. Alexander von Konstantinopel, damals ein Presbyter, war ebenfalls als Vertreter seines betagten Bischofs anwesend.