Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung

Geschichte

Die ersten Forschungsarbeiten zur Gas-Flüssigkeits-Chromatographie wurden 1950 veröffentlicht. Die Chemiker benutzten verschiedene Detektoren, um zu sehen, dass Verbindungen aus dem Ende des Chromatographen ausfließen. Die meisten der Detektoren zerstörten die Verbindungen, weil sie sie verbrannten oder ionisierten. Mit diesen Detektoren konnten die Chemiker die genaue Identität jeder Verbindung in der Probe erraten. In den 1950er Jahren entwickelten Roland Gohlke und Fred McLafferty ein neues kombiniertes Gerät. Sie verwendeten ein Massenspektrometer als Detektor in der Gaschromatographie. Diese frühen Geräte waren groß, zerbrechlich und ursprünglich auf Laboreinrichtungen beschränkt.

Der Entwurf war komplex. Das Zeitintervall zwischen verschiedenen Verbindungen, die aus dem Chromatographen ausflossen, war schwer zu kontrollieren. Daher musste das Massenspektrometer die Arbeit an einer Verbindung beenden, bevor die nächste aus dem Chromatographen floss. In den frühen Modellen wurden die Messungen des Massenspektrometers auf Millimeterpapier aufgezeichnet. Hochqualifizierte Chemiker untersuchten die Muster der Peaks, um jede Verbindung zu identifizieren. In den 1970er Jahren wurden die Massenspektrometer durch Analog-Digital-Wandler ergänzt. Dies ermöglichte es Computern, die Ergebnisse zu speichern und zu interpretieren. Als die Computer immer schneller und kleiner wurden, wurde die GC-MS immer schneller und verbreitete sich aus den Labors in den Alltag. Heute sind computergestützte GC-MS-Instrumente bei der Umweltüberwachung von Wasser, Luft und Boden weit verbreitet. Sie wird auch bei der Regulierung der Landwirtschaft, der Lebensmittelsicherheit und bei der Entdeckung und Herstellung von Medikamenten eingesetzt.

Die Entwicklung von Kleincomputern hat zur Vereinfachung von GC-MS-Maschinen beigetragen. Sie hat auch den Zeitaufwand für die Analyse einer Probe stark reduziert. Electronic Associates, Inc. (EAI) war ein führender US-amerikanischer Anbieter von Analogrechnern. Im Jahr 1964 begann EAI unter der Leitung von Robert E. Finnigan mit der Entwicklung eines computergesteuerten Massenspektrometers. Bis 1966 wurden über 500 Gasanalysegeräte verkauft. 1967 wurde die Finnigan Instrument Corporation (FIC) gegründet. Anfang 1968 lieferte sie die ersten Prototyp-Quadrapol-GC-MS-Instrumente an die Stanford and Purdue University. FIC wurde schließlich in Finnigan Corporation umbenannt und etablierte sich als weltweit führender Anbieter von GC-MS-Systemen.

Grundlegende Bedienung

GC-MS kann alle Verbindungen finden, die in einem Musterobjekt miteinander vermischt sind. Der Bediener löst die Probe in einer Flüssigkeit auf. Anschließend injiziert der Bediener die Flüssigkeit in einen Gasstrom. (Am häufigsten werden Helium-, Wasserstoff- oder Stickstoffgas verwendet.) Das Gas strömt durch ein Rohr mit einer speziellen Beschichtung. Da jede Verbindung in der Probe auf unterschiedliche Weise an der Beschichtung haftet, kommt jede Verbindung zu einem anderen Zeitpunkt aus dem Rohr heraus. Die Beschichtung wird also verwendet, um jede Verbindung zu trennen, die in der Probe zusammengemischt wurde. Wenn jede Verbindung am Ende des Röhrchens herauskommt, wird sie ionisiert und erhält eine elektrische Ladung. Die meisten Verbindungen brechen auseinander, wenn sie ionisiert werden. Die verschiedenen Stücke fliegen unter einem Magneten, der die Stücke aufgrund ihres Gewichts und ihrer Ladung trennt. Ein Computer misst dann alle Stücke jeder Verbindung. Durch Vergleich der Messungen mit einer Computerbibliothek bekannter Verbindungen erstellt der Computer eine Liste mit den Namen aller Verbindungen in der Probe. Der Computer kann auch feststellen, wie viel von jeder Verbindung in der Probe enthalten war.

Instrumentierung

Die GC-MS setzt sich aus zwei Hauptbausteinen zusammen: dem Gaschromatographen und dem Massenspektrometer. Der Gaschromatograph verwendet eine Kapillarsäule, die sowohl von den Abmessungen der Säule (Länge, Durchmesser, Filmdicke) als auch von den Phaseneigenschaften (z.B. 5% Phenylpolysiloxan) abhängt. Der Unterschied in den chemischen Eigenschaften zwischen verschiedenen Molekülen in einer Mischung trennt die Moleküle, während die Probe die Länge der Säule durchläuft. Die Moleküle benötigen unterschiedlich viel Zeit (Retentionszeit genannt), um aus dem Gaschromatographen herauszukommen (zu eluieren). Dies ermöglicht es dem nachgeschalteten Massenspektrometer, die ionisierten Moleküle getrennt einzufangen, zu ionisieren, zu beschleunigen, abzulenken und zu detektieren. Das Massenspektrometer tut dies, indem es jedes Molekül in ionisierte Fragmente zerlegt und diese Fragmente anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses nachweist.

Diese beiden Geräte, die zusammen verwendet werden, ermöglichen eine viel feinere Präzision der Substanzidentifizierung als jede der beiden getrennt verwendeten Einheiten. Es ist nicht möglich, ein bestimmtes Molekül allein durch Gaschromatographie oder Massenspektrometrie genau zu identifizieren. Der Massenspektrometrieprozess erfordert normalerweise eine sehr reine Probe. In der Vergangenheit wurden bei der Gaschromatographie andere Detektoren wie z.B. ein Flammenionisationsdetektor verwendet. Diese Detektoren können verschiedene Moleküle nicht trennen, die zufällig die gleiche Zeit benötigen, um durch die Säule zu wandern. (Wenn zwei verschiedene Moleküle die gleiche Retentionszeit haben, sagt man, dass sie "co-eluieren"). Die co-eluierenden Moleküle verwirren die Computerprogramme, die ein einziges Massenspektrum für beide Moleküle lesen.

Manchmal können auch zwei verschiedene Moleküle in einem Massenspektrometer (Massenspektrum) ein ähnliches Muster von ionisierten Fragmenten aufweisen. Die Kombination der beiden Verfahren reduziert die Möglichkeit von Fehlern. Es ist äusserst unwahrscheinlich, dass sich zwei verschiedene Moleküle sowohl in einem Gaschromatographen als auch in einem Massenspektrometer auf die gleiche Weise verhalten. Wenn ein Massenspektrum mit dem interessierenden Analyten übereinstimmt, kann daher die Retentionszeit dieses Spektrums gegen eine charakteristische GC-Retentionszeit geprüft werden, um die Sicherheit zu erhöhen, dass sich der Analyt in der Probe befindet.

Arten von Massenspektrometer-Detektoren

Die häufigste mit einer GC assoziierte Art von MS ist das Quadrupol-Massenspektrometer. Hewlett-Packard (jetzt Agilent) vermarktet es unter dem Handelsnamen "Mass Selective Detector" (MSD). Ein weiterer relativ verbreiteter Detektor ist das Ionenfallen-Massenspektrometer. Zusätzlich kann man ein Magnetsektor-Massenspektrometer finden. Diese speziellen Geräte sind jedoch teuer und sperrig und werden in der Regel nicht in Dienstleistungslabors mit hohem Durchsatz eingesetzt. Andere Detektoren werden verwendet, wie z.B. Time of flight (TOF), Tandem-Quadrupole (MS-MS) (siehe unten) oder im Falle einer Ionenfalle MSn. Das n gibt die Anzahl der Massenspektrometrie-Stufen an.

Das Innere des GC-MS, mit der Säule des Gaschromatographen im Ofen auf der rechten Seite.


GC-MS-Schema

Analyse

Ein Massenspektrometer wird normalerweise auf eine von zwei Arten verwendet: Vollabtastung oder selektive Ionenüberwachung (SIM). Die typische GC-MS kann so oder so allein oder beides gleichzeitig arbeiten.

Vollständige Abtastung MS

Bei der Datenerfassung im Full-Scan-Modus wird ein Zielbereich von Massenfragmenten ausgewählt und in die Methode des Instruments eingegeben. Ein Beispiel für einen typischen breiten Bereich von zu überwachenden Massenfragmenten wäre m/z 50 bis m/z 400. Die Bestimmung des zu verwendenden Bereichs hängt weitgehend davon ab, was man erwartet, wenn man sich in der Probe befindet, wobei man sich des Lösungsmittels und anderer möglicher Interferenzen bewusst ist. Wenn eine MS nach Massenfragmenten mit einem sehr niedrigen m/z sucht, kann sie Luft oder andere mögliche Störfaktoren feststellen. Die Verwendung eines großen Scanbereichs verringert die Empfindlichkeit des Instruments. Das Gerät führt weniger Scans pro Sekunde durch, da jeder Scan mehr Zeit benötigt, um einen größeren Bereich von Massenfragmenten zu erkennen.

Full Scan ist nützlich, um unbekannte Verbindungen in einer Probe zu bestimmen. Er liefert mehr Informationen als SIM, wenn es darum geht, Verbindungen in einer Probe zu bestätigen oder aufzulösen. Die meisten Instrumente werden von einem Computer gesteuert, der ein Computerprogramm namens "Instrumentenmethode" betreibt. Die Instrumentenmethode steuert die Temperatur in der GC, die MS-Scan-Rate und den Bereich der zu erfassenden Fragmentgrößen. Wenn ein Chemiker eine Instrumentenmethode entwickelt, sendet der Chemiker Testlösungen im Vollabtastmodus durch das GS-MS. Dieses prüft die GC-Retentionszeit und den Fingerabdruck des Massenfragments, bevor es zu einer SIM-Instrumentenmethode übergeht. Spezielle GC-MS-Instrumente, wie z.B. Sprengstoffdetektoren, haben eine Instrumentenmethode, die im Werk vorinstalliert ist.

Ausgewählte Ionen-Überwachung

Beim Selected Ion Monitoring (SIM) konzentriert sich die Gerätemethode auf bestimmte Ionenfragmente. Nur diese Massenfragmente werden durch das Massenspektrometer erfasst. Die Vorteile von SIM liegen darin, dass die Nachweisgrenze niedriger ist, da das Gerät bei jedem Scan nur eine kleine Anzahl von Fragmenten (z.B. drei Fragmente) betrachtet. Pro Sekunde können mehr Scans durchgeführt werden. Da nur einige wenige Massenfragmente von Interesse überwacht werden, sind Matrix-Interferenzen typischerweise geringer. Um die Chancen zu verbessern, ein positives Ergebnis korrekt abzulesen, sind die Ionenverhältnisse der verschiedenen Massenfragmente mit einem bekannten Referenzstandard vergleichbar.

Arten der Ionisierung

Nachdem die Moleküle die Länge der Säule durchlaufen haben, die Transferleitung durchlaufen haben und in das Massenspektrometer eintreten, werden sie durch verschiedene Methoden ionisiert. Normalerweise wird immer nur eine Ionisationsmethode zu einem bestimmten Zeitpunkt verwendet. Sobald die Probe fragmentiert ist, wird sie erfasst, üblicherweise durch eine Elektronenvervielfacherdiode. Die Diode behandelt das ionisierte Massenfragment wie ein elektrisches Signal, das dann detektiert wird.

Chemiker wählen eine Ionisierungstechnik getrennt von der Wahl der Full Scan- oder SIM-Überwachung.

Elektronen-Ionisation

Die häufigste Art der Ionisation ist die Elektronenionisation (EI). Die Moleküle treten in die MS ein (die Quelle ist ein Quadrupol oder die Ionenfalle selbst in einer Ionenfalle MS), wo sie mit freien Elektronen getroffen werden, die von einem Filament emittiert werden. Dies entspricht dem Glühfaden, den man in einer normalen Glühbirne vorfindet. Die Elektronen treffen auf die Moleküle, wodurch das Molekül in einer charakteristischen, wiederholbaren Weise fragmentiert wird. Diese "harte Ionisierungs"-Technik führt zur Erzeugung weiterer Fragmente mit niedrigem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z). EI hat wenige, wenn überhaupt, Fragmente mit einer Masse, die nahe der Masse des ursprünglichen Moleküls liegt. Chemiker betrachten harte Ionisation als das Einschießen von Elektronen in die Probenmoleküle. Im Gegensatz dazu wird bei der "weichen Ionisierung" das Probenmolekül durch Auftreffen eines eingeleiteten Gases aufgeladen. Das molekulare Fragmentierungsmuster hängt von der an das System angelegten Elektronenenergie ab, typischerweise 70 eV (Elektronenvolt). Die Verwendung von 70 eV hilft, die von der Testprobe erzeugten Spektren mit bekannten Bibliotheksspektren zu vergleichen. (Die Bibliotheksspektren können von vom Hersteller gelieferter Software oder vom National Institute of Standards (NIST-USA) entwickelter Software stammen). Die Software durchsucht die Bibliotheksspektren mit Hilfe eines Matching-Algorithmus wie z.B. Probability Based Matching oder Punkt-Produkt-Matching. Viele Agenturen für Methodenstandardisierung kontrollieren heute diese Algorithmen und Methoden, um ihre Objektivität zu gewährleisten.

Chemische Ionisierung

Bei der chemischen Ionisation (CI) wird ein Reagenzgas, typischerweise Methan oder Ammoniak, in das Massenspektrometer gegeben. Es gibt zwei Arten von CI: positives CI oder negatives CI. In beiden Fällen tritt das Reagenzgas mit den Elektronen und dem Analyten in Wechselwirkung und verursacht eine "weiche" Ionisierung des interessierenden Moleküls. Eine "weiche" Ionisierung fragmentiert das Molekül in geringerem Maße als die harte Ionisierung von EI. Chemiker bevorzugen CI gegenüber EI. Der Grund dafür ist, dass CI mindestens ein Massenfragment mit einem Gewicht erzeugt, das nahezu dem Molekulargewicht des interessierenden Analyten entspricht.

Positive chemische Ionisierung

Bei der Positiven Chemischen Ionisation (PCI) interagiert das Reagenzgas mit dem Zielmolekül, meist mit einem Protonenaustausch. Dabei entstehen die Ionenspezies in relativ hohen Mengen.

Negative chemische Ionisierung

Bei der Negativen Chemischen Ionisation (NCI) verringert das Reagenzgas den Einfluss der freien Elektronen auf den Zielanalyten. Diese verringerte Energie lässt das Fragment typischerweise in großer Menge zur Verfügung stehen. (Die Fragmente brechen nicht weiter auf).

Auslegung

Das primäre Ziel der Instrumentenanalyse ist die Messung einer Substanzmenge. Dies geschieht durch Vergleich der relativen Konzentrationen zwischen den Atommassen im erzeugten Massenspektrum. Zwei Arten der Analyse sind möglich, eine vergleichende und eine originelle. Bei der vergleichenden Analyse wird im Wesentlichen das gegebene Spektrum mit einer Spektrenbibliothek verglichen, um festzustellen, ob seine Eigenschaften für eine bekannte Probe in der Bibliothek vorhanden sind. Dies wird am besten von einem Computer durchgeführt, da es viele visuelle Verzerrungen gibt, die aufgrund von Maßstabsvariationen auftreten können. Computer können auch mehr Daten korrelieren (z. B. die von der GC ermittelten Retentionszeiten), um bestimmte Daten genauer in Beziehung zu setzen.

Eine andere Analysemethode misst die Peaks im Verhältnis zueinander. Bei dieser Methode wird der höchste Peak auf 100% gesetzt. Die anderen Peaks erhalten einen Wert, der dem Verhältnis der Peakhöhe zur höchsten Peakhöhe entspricht. Alle Werte über 3% werden zugewiesen. Die Gesamtmasse der unbekannten Verbindung wird normalerweise durch den Elternpeak angegeben. Der Wert dieses Elternpeaks kann zur Anpassung an eine chemische Formel verwendet werden, die die verschiedenen Elemente enthält, von denen angenommen wird, dass sie in der Verbindung enthalten sind. Das Isotopenmuster im Spektrum ist für Elemente, die viele Isotope aufweisen, einzigartig. Es kann also auch verwendet werden, um die verschiedenen vorhandenen Elemente zu identifizieren. Dadurch lässt sich die chemische Gesamtformel des unbekannten Moleküls ermitteln. Da die Struktur und die Bindungen eines Moleküls auf charakteristische Weise auseinander brechen, können sie aus dem Unterschied der Spitzenmassen identifiziert werden. Die identifizierte Molekülstruktur muss mit den von der GC-MS aufgezeichneten Merkmalen übereinstimmen. Normalerweise erfolgt diese Identifizierung automatisch durch Computerprogramme, die mit dem Gerät geliefert werden. Diese Programme gleichen die Spektren mit einer Bibliothek bekannter Verbindungen ab, die dieselbe Liste von Elementen aufweisen, die in der Probe vorhanden sein könnten.

Eine "Vollspektrum"-Analyse berücksichtigt alle "Peaks" innerhalb eines Spektrums. Bei der selektiven Ionenüberwachung (SIM) werden jedoch nur ausgewählte Peaks überwacht, die mit einer bestimmten Substanz assoziiert sind. Chemiker gehen davon aus, dass bei einer bestimmten Retentionszeit ein Satz von Ionen charakteristisch für eine bestimmte Verbindung ist. SIM ist eine schnelle und effiziente Analyse. SIM funktioniert am besten, wenn der Analytiker über frühere Informationen zu einer Probe verfügt oder nur nach einigen wenigen spezifischen Substanzen sucht. Wenn die Menge der gesammelten Informationen über die Ionen in einem bestimmten gaschromatographischen Peak abnimmt, steigt die Empfindlichkeit der Analyse. Mit der SIM-Analyse kann also eine kleinere Menge einer Verbindung nachgewiesen und gemessen werden. Der Grad der Gewissheit über die Identität dieser Verbindung ist jedoch geringer.

GC-Tandem-MS

Wenn eine zweite Phase der Massenfragmentierung hinzugefügt wird, z.B. unter Verwendung eines zweiten Quadrupols in einem Quadrupolinstrument, spricht man von Tandem-MS (MS/MS). MS/MS eignen sich gut zur Messung niedriger Konzentrationen von Zielverbindungen in einer Probe mit einer Matrix von Hintergrundverbindungen, die nicht von Interesse sind.

Der erste Quadrupol (Q1) ist mit einer Kollisionszelle (q2) und einem weiteren Quadrupol (Q3) verbunden. Beide Quadrupole können im Scan- oder statischen Modus verwendet werden, je nach Art der verwendeten MS/MS-Analyse. Zu den Analysetypen gehören Produkt-Ionen-Scan, Vorläufer-Ionen-Scan, Selected Reaction Monitoring (SRM) und Neutralverlust-Scan. Zum Beispiel: Wenn sich Q1 im statischen Modus befindet (wie bei SIM nur eine Masse betrachtet) und Q3 im Scan-Modus, erhält man ein so genanntes Produkt-Ionenspektrum (auch "Tochter-Spektrum" genannt). Aus diesem Spektrum kann man ein markantes Produkt-Ion auswählen, das das Produkt-Ion für das gewählte Vorläufer-Ion sein kann. Das Paar wird als "Übergang" bezeichnet und bildet die Grundlage für SRM. SRM ist hochspezifisch und eliminiert den Matrixhintergrund fast vollständig.

Bewerbungen

Umweltüberwachung und -sanierung

Viele Chemiker glauben, dass GC-MS das beste Instrument zur Überwachung organischer Schadstoffe in der Umwelt ist. Die Kosten für GC-MS-Geräte sind stark gesunken. Gleichzeitig hat die Zuverlässigkeit von GC-MS zugenommen. Beide Verbesserungen haben den Einsatz in Umweltstudien erhöht. Einige Verbindungen, wie z.B. bestimmte Pestizide und Herbizide, können mit GS-MS nicht identifiziert werden. Sie sind anderen verwandten Verbindungen zu ähnlich. Aber für die meisten organischen Analysen von Umweltproben, einschließlich vieler Hauptklassen von Pestiziden, ist GC-MS sehr empfindlich und wirksam.

Kriminelle Forensik

GC-MS kann die Partikel aus einem menschlichen Körper analysieren, um einen Kriminellen mit einem Verbrechen in Verbindung zu bringen. Das Gesetz akzeptiert die Verwendung von GC-MS zur Analyse von Brandrückständen. Tatsächlich hat die American Society for Testing Materials (ASTM) eine Norm für die Analyse von Brandschutt. GCMS/MS ist hier besonders nützlich, da Proben oft sehr komplexe Matrizen enthalten und Ergebnisse, die vor Gericht verwendet werden, sehr genau sein müssen.

Rechtsdurchsetzung

GC-MS wird zur Aufspürung illegaler Betäubungsmittel eingesetzt und könnte eventuell Drogenspürhunde ersetzen. Es wird auch häufig in der forensischen Toxikologie eingesetzt. Es hilft, Drogen und/oder Gifte in biologischen Proben zu finden, die von Verdächtigen, Opfern oder einer Leiche entnommen wurden.

Sicherheit

Nach den Terroranschlägen vom 11. September 2001 sind Sprengstoffdetektionssysteme Bestandteil aller US-Flughäfen geworden. Diese Systeme laufen auf einer Vielzahl von Technologien, viele davon auf der Basis von GC-MS. Es gibt nur drei Hersteller, die von der FAA für die Bereitstellung dieser Systeme zertifiziert sind. Der erste ist die Firma Thermo Detection (ehemals Thermedics), die das EGIS, eine auf GC-MS basierende Reihe von Sprengstoffdetektoren, herstellt. Die zweite ist Barringer Technologies, die sich jetzt im Besitz von Smith's Detection Systems befindet. Die dritte ist Ion Track Instruments (Teil von General Electric Infrastructure Security Systems).

Analyse von Lebensmitteln, Getränken und Parfüm

Lebensmittel und Getränke enthalten viele aromatische Verbindungen, die zum Teil natürlich in den Rohstoffen enthalten sind und zum Teil bei der Verarbeitung entstehen. Für die Analyse dieser Verbindungen, zu denen Ester, Fettsäuren, Alkohole, Aldehyde, Terpene usw. gehören, wird GC-MS in großem Umfang eingesetzt. Es wird auch zum Nachweis und zur Messung von Verunreinigungen durch Verderb oder Verfälschung verwendet, die schädlich sein können. Die Kontaminanten werden oft von Regierungsbehörden kontrolliert, z.B. Pestizide.

Astrochemie

Mehrere GC-MS haben die Erde verlassen. Zwei gingen im Rahmen des Viking-Programms zum Mars. Venera 11 und 12 und Pioneer Venus analysierten die Atmosphäre der Venus mit GC-MS. Die Huygens-Sonde der Cassini-Huygens-Mission landete eine GC-MS auf dem größten Saturnmond Titan. Das Material im Kometen 67P/Churyumov-Gerasimenko wird 2014 von der Rosetta-Mission mit einer chiralen GC-MS analysiert.

Medizin

GC-MS werden in Neugeborenen-Screeningtests eingesetzt. Diese Tests können Dutzende von angeborenen Stoffwechselkrankheiten (auch bekannt als angeborener Stoffwechselfehler) finden. GC-MS kann Verbindungen im Urin auch in sehr kleinen Mengen bestimmen. Diese Verbindungen sind normalerweise nicht vorhanden, treten aber bei Personen auf, die an Stoffwechselstörungen leiden. Dies entwickelt sich zu einer gängigen Methode zur Diagnose von IEM für eine frühere Diagnose und den Beginn einer Behandlung. Dies führt schließlich zu einem besseren Ergebnis. Es ist jetzt möglich, ein Neugeborenes auf über 100 genetische Stoffwechselstörungen durch einen Urintest bei der Geburt auf der Basis von GC-MS zu testen.

In Kombination mit der Isotopenmarkierung von Stoffwechselverbindungen wird die GC-MS zur Bestimmung der Stoffwechselaktivität eingesetzt. Die meisten Anwendungen basieren auf der Verwendung von ^13C als Markierung und der Messung von 13C-12C-Verhältnissen mit einem Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS). Ein IRMS ist ein Massenspektrometer mit einem Detektor, der so konzipiert ist, dass er einige wenige ausgewählte Ionen misst und die Werte als Verhältnisse zurückgibt.